Грант РНФ 16-15-10026 Скелетные мышцы как эндокринный орган: роль натрий-калий опосредованного механизма регуляции транскрипции

Грант РНФ 16-15-10026
Скелетные мышцы как эндокринный орган: роль натрий-калий опосредованного механизма регуляции транскрипции
 
Научный руководитель: профессор Орлов Сергей Николаевич
Основные исполнители:
  1. Капилевич Леонид Владимирович
  2. Дьякова Елена Юрьевна
  3. Кабачкова Анастасия Владимировна
 
 
Скелетные мышцы составляют до 40% от общей массы тела и содержат 50-75% всех белков организма. Мышцы, как часть опорно-двигательного аппарата, обеспечивают двигательную деятельность, а также участвуют в поддержании поз и положений тела. За последние два десятилетия было доказано, что скелетные мышцы функционируют как эндокринный орган, секретируют десятки миокинов – регуляторных белков, имеющих различное физиологическое и патофизиологическое значение. Повышение концентрации внутриклеточного Ca2+([Ca2+]i), гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1 альфа и АМФ-чувствительной киназы (AMPK) рассматриваются как факторы, стимулирующие транскрипцию и трансляцию миокинов в клетках скелетных мышц. Тем не менее, их относительное участие продукции миокинов в ответ на физическую нагрузку остается недостаточно изученной.
Хорошо известно, однако, что в скелетных мышцах при интенсивном сокращении происходит диссипация трансмембранных градиентов натрия и калия, вызванное активацией Na+ и K+ каналов. Недавно мы показали, что увеличение соотношения внутриклеточных концентраций Na+ и K+ ([Na+]i/[K+]i)  вызывает экспрессию десятков генов, включая несколько миокинов, таких как IL-6 и COX-2, в присутствии внутри- и внеклеточных хелатов Ca2+. Мы также установили, что этот механизм играет ключевую роль в транскриптомных изменениях гладкомышечных клеткок в условиях гипоксии. Эти данные позволили предположить, что увеличение соотношения [Na+]i/[K+]i в ответ на физическую нагрузку способствует секреции миокинов в скелетных мышцах независимо от увеличения [Ca2+]i, а также активации HIF-1 альфа и AMPK. Чтобы проверить эту гипотезу, планируется выполнить следующие исследования. Во-первых, мы сравним действие электрической стимуляции (EPS) и ингибирования Na+, K+- АТФазы на внутриклеточное содержание Na+, K+ и транскрипцию/трансляцию миокинов на культурах скелетных мышц человека и экспериментальных животных, с конечной целью идентификации набора Na+i/K+i-чувствительных миокинов. Во-вторых, мы планируем изучить относительное влияние [Ca2+]i -опосредованной и -независимой сигнализации на продукцию миокинов вызванную изменением [Na+]i/[K+]i соотношения. В-третьих, мы рассмотрим роль HIF-1α и AMPK в продукции миокинов клетками скелетной мускулатуры, вызванной EPS.
В ходе выполнения данного проекта будут определены дозы уабаина, вызывающие повышение соотношения [Na+]i/[K+]i до уровня, отмеченного в клетках скелетной мускулатуры, подвергшихся воздействию электрической стимуляции. Будет проведено сравнение влияния уабаина и электрической стимуляции на экспрессию миокинов при диссипации трансмембранного градиента одновалентных катионов. С помощью этого подхода будет определен набор Na+i/K+i-чувствительных миокинов, экспрессия которых опосредована активацией канонического Ca2+-опосредованного и нового Ca2+-независимого механизма регуляции транскрипции и трансляции, обнаруженного в нашей лаборатории. В заключительной части работы будет определен набор Na+/K+-чувствительных, Ca2+i-независимых миокинов, экспрессия которых опосредована HIF-1a- и AMPK-независимым механизмом регуляции транскрипции и трансляции.
В свое время расшифровка запуска механизма транскрипции генов цитокинов при иммунном ответе позволила обнаружить новые эффективные методы лечения инфекционных заболеваний. Расшифровка механизма запуска транскрипции генов миокинов даст возможность найти новые патогенетически обоснованные методы лечения таких заболеваний как нарушения обмена веществ (сахарный диабет, ожирение, ревматизм, атеросклероз и др.), сердечно-сосудистые заболевания, мышечные дистрофии и обнаружить пути профилактики онкологических болезней.
Миокины все чаще рассматривают не только как патофизиологическая основа профилактического действия физических нагрузок, но и как потенциальные средство для лечения больных с ревматическими заболеваниями, caхарным диабетом, ожирением, атеросклерозом. В этой связи, идентификация начальных механизмов регуляции секреции миокинов в ответ на физическую нагрузку как основная цель нашего проекта позволит разработать новые подходы лечения перечисленных выше социально-значимых заболеваний, связанных с современными условиями жизни.
 
 
Skeletal muscles represent up to 40% of the total body mass and contain 50-75% of all body proteins. As a part of the musculoskeletal system it maintains posture and provides locomotion. During the last two decades it was shown that skeletal muscles also function as an exercise-dependent endocrine organ secreting dozens of myokines, i.e. regulatory proteins having diverse physiological and pathophysiological implications. Elevation of intracellular Ca2+ ([Ca2+]i),  hypoxia-inducible factor HIF-1a and AMP-sensitive protein kinase (AMPK) are considered as upstream signals affecting myokine transcription, translation in exercising muscles. However, their relative impact in overall changes of skeletal muscle transcriptome and proteome remain poorly understood.
It is well documented that in skeletal muscles intensive exercise triggers dissipation of transmembrane gradient of monovalent cations caused by permanent activation of voltage-gated Na+ and K+ channels. Recently, we demonstrated that sustained elevation of the intracellular Na+/K+ ratio ([Na+]i/[K+]i) triggers expression of dozens ubiquitous genes including several canonical myokines, such as interleukin 6 and cyclooxygenase 2, in the presence of intra- and extracellular Ca2+ chelators. We also observed that this novel mechanism of excitation-transcription coupling plays a key role in transcriptomic changes triggered in smooth muscle cells by hypoxia. These data allowed us to suggest that dissipation of transmembrane gradient of Na+ and K+ contributes to myokine secretion by exercising skeletal muscles independently of elevation of [Ca2+]i, HIF-1a  and AMPK activation. To examine this hypothesis, we will perform following studies. Firstly, we will compare dose-dependent actions of electrical pulse stimulation (EPS) and Na+,K+-ATPase inhibition on intracellular Na+ and K+ content and transcription/translation of canonical myokines in cultured skeletal muscle cells with a final goal of identification of a set of Na+i/K+i-sensitive myokines. Secondly, we plan to examine relative impact of [Ca2+]i-mediated and -independent signaling in myokine expression triggered by elevation of the [Na+]i/[K+]i ratio. Finally, we will examine the role of HIF-1a and AMPK in myokine expression triggered by EPS.
Under completion of our project we will find the doses of ouabain possessing the same elevation of the Na/K ratio as those observed in skeletal muscle cells subjected to electrical pulse stimulation. We will also compare the action of ouabain and electrical pulse stimulation on myokine expression under dissipation of a transmembrane gradient of monovalent cations. With this approach, we will determine the set of Na/K-sensitive myokines whose expression in exercising muscles is mediated by activation of the canonical Ca2+-mediated and novel Ca2+-independent mechanism of excitation-transcription/translation coupling discovered in our laboratory. Finally, we will determine the set of Na+i/K+i-sensitive, Ca2+i-independent myokines whose expression in exercising muscles is mediated by activation of Na/K-sensitive, HIF-1alfa- and AMPK-independent mechanisms of excitation-transcription/translation coupling.
In the past, the investigation of cytokine transcription mechanisms as a molecular basis of the immune response led to the development of new approaches of treatment of infectious diseases and inflammation. The identification of the upstream intermediates of myokine transcription gives the opportunity to find new pathogenetically based approach for the treatment of complex disorders including metabolic abnormalities (diabetes, obesity, rheumatism, atherosclerosis, etc.), cardiovascular diseases, muscular dystrophy, and cancer prevention.
Myokines are viewed not only as the pathophysiological basis for preventative action of physical activity, but also as a potential agent for the treatment of socially significant diseases such as rheumatic disease, diabetes, obesity, and atherosclerosis. Thus, the primary aim of this project is to identify the regulatory mechanisms of myokine secretion in response to physical activity. These findings will develop new treatment approaches of socially significant diseases related to modern living conditions.